|
Definition & Bedeutung
Geschichte r />
PCR in der Praxis
Ablauf
Anwendung - # genetischer Fingerabdruck
# Vaterschaftstest
# Analyse alter (fossiler) DNA
Definition & Bedeutung
ð Methode, um die Erbsubstanz DNA zu vervielfältigen, ohne einen lebenden Organismus zu
benutzen
ð schnelle Vermehrung winziger DNA - Mengen
Geschichte
1983 von Kary Banks Mullis entwickelt
1993 für Entdeckung Nobelpreis für Chemie
Idee: Verfahren zu entwickeln, das DNA durch wiederholte Verdoppelung in mehreren Zyklen mit Hilfe eines Enzyms ( DNA Polymerase) künstlich zu vervielfältgen
DNA Polymerase kommt in allen Lebewesen vor
bindet an einzelnen DNA -Strang & erzeugt komplementären Strang
in Mullis ursprünglichen Versuchen wurde Enzym in vitro verwendet
doppelsträngige DNA durch Erhitzen auf 96°C in zwei Einzelstränge aufgeteilt
bei dieser Temperatur DNA -Polymerase zerstört
daher nach jedem Erhitzen erneut zugeführt werden
Mullis ursprüngliches Verfahren sehr ineffizient à erforderte viel Zeit, große Mengen Polymerase und ständige Aufmerksamkeit
später PCR- Prozess verbessert
nahm DNA -Polymerase von thermophilen (Hitze liebende) Bakterien (leben bei über 100 °C in Geysiren)
DNA -Polymerase ist thermostabil à bei Erhitzen während PCR- Zyklen nicht zerstört
musste nicht mehr ständig DNA -Polymerase hinzugefügt werden
ð Vervielfältigungprozess konnte erheblich vereinfacht und automatisiert werden
eine ersten thermostabilen DNA -Polymersaen aus Thermophilus aquaticus gewonnen à Taq genannt
Nachteil Taq- Polymerase: produziert manchmal Fehler beim Kopieren der DNA à führt zu Mutationen
Polymerasen wie PWO & PFU (aus Archaea gewonnen) haben Korrektur- Mechanismus, der Anzahl Mutationen in kopierter DNA erheblich senkt
3. PCR in der Praxis
dient zur Vervielfäktigung von kurzen, genau definierten Teil eines DNA -Strangs
kann ein Gen oder nur ein Teil eines Gens sein
PCR- Prozess kann nur kurze DNA -Abschnitte bis zu ca. 10kbp (10,000 Basenpaare) kopieren
mit Hilfe bestimmter Verfahren könn Fragmente bis zu 40kbp vervielfältigt werden
immer noch sehr wenig à menschliche Zelle enthält etwa 3 Milliarden Basenpaare
in momentaner Anwendung benötogt PCR mehrere grundlegende Komponenten
# Original DNA die zu vervielfältigenden Abschnitt enthält
# zwei primer , um Anfang und Ende des Abschnittes festzulegen
# DNA -Polymerase um festgelegten Abschnitt zu kopieren
# Nucleotide (Bausteine für DNA -Strang)
# Pufferlösungen, die eine für DNA -Polymerase geeignete chemische Umgebung sicherstellt
PCR findet in Thermocycler statt
Maschine erhitzt & kühlt Reaktiongefäße präzise auf benötigte Temperatur
4. Anwendung
kann für Vielzahl von Experimenten & Analysen eingesetzt werden
Genetischer Fingerabdruck
in Gerichtmedizin zur Identifikation einer Person
DNA mit vorhandener Probe verglichen
Bsp: Blutprobe von Verbrechensschauplatz mit Blut eines Verdächtigen vergleichen
Probe muss nur geringe Mengen DNA enthalten, die man aus Blut, Sperma, Speichel, Haaren oder ähnlichem gewinnen kann
theoretisch genügt einziger Strang
zuerst Spaltung DNA -Probe in Fragmente; dann Vervielfältigung mittels PCR
Fragmente durch Gelelektrophorese getrennt
so gewonnene Anordnung DNA -Fragmente nennt man DNA -Fingerabdruck
Vaterschaftstest
allgemein: Überprüfung von DNA -Regionen verschiedener Personen um eine Verwandtschaft festzustellen
je mehr Regionen auf Übereinstimmung geprüft werden dest sicherer das Ergebnis
deutsche Ärztekammer empfiehlt mindestens 16 dieser Regionen testen zu lassen
Gegensatz zu früher: üblicher Blutgruppentest, der Vaterschaft nur ausschliessen aber nicht belegen konnte
heute fast 100%er Vaterschaftsnachweis
ursprünglich in Sorgerechtsverfahren
Analyse alter DNA
in manchen Fossilien DNA noch in Bruchstücken vorhanden
Mengen aber meist sehr klein
durch PCR wird es möglich, DNA zu analysieren die tausende Jahre alt ist
PCR- Techniken erfolgreich bei Tieren wie einem 40.000 Jahre alten Mammut eingesetzt
auch an menschlicher DNA wobei Anwendung von Untersuchung ägyptischer Mumien bis zur Identifizierung eines russischen Zaren reichen
durch PCR vervielfältigte DNA wird sequenziert
aus Abfolge Basenpaare im Vergleich zu anderen Sequenzen können dann Rückschlüsse auf Verwandtschaft gezogen werden
durch diese Methode beispielsweise Hinweise, dass heutige Menschenart Homo sapiens nicht aus dem Homo neanderthalensis hervorgegegangen ist
obwohl beide zeitgleich in Europa existierten
weitere Anwendungen à Mutagenese, Klonierung von Genen, Erkennung von Erbkrankheiten
|
