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philosophie artikel (Interpretation und charakterisierung)

Restriktionsenzyme





Diese Enzyme wurden von dem Schweitzer Arber und von den Amerikanern Smith und Wilson Ende der sechziger Jahre entdeckt. Nun war es möglich , DNA gezielt in kleinere Stücke zu zerschneiden und damit zu experimentieren. Zuvor war das Experimentieren mit DNA noch nicht möglich. Die Restriktionsendonucleasen wurden entdeckt als man bemerkte, das bestimmte Bakterien eindringende Fremd-DNA z.B. Bakteriophagen-DNA in viele kleine Stücke schneiden können und sich somit gegen solche Übergriffe schützen können. Heutzutage sind etwa 500 dieser Enzyme bekannt. Der hauptsächlicher Unterschied zwischen den verschiedenen Restriktionsenzymen liegt in der Art, wie sie die DNA zerschneiden. Manche erzeugen glatte Enden und bei manchen entstehen überstehende Einzelstrang-Enden, da sie die DNA versetzt aufschneiden. Die verschiedenen Restriktionsendonucleasen erkennen verschiedene Nukleotidsequenzen. Diese variieren in Zusammensetzung und Länge. Erkennt ein Enzym z.B. eine bestimmte Folge von 4 Nukleotiden, so sind die entstehenden Fragmente im mittel 256 Basenpaare lang (1/44 = 256 | 1/Anzahl der m. Nukleotide ^Erkennungslänge).
Nach dem die DNA fragmentiert wurde, kann man die DNA-Fragmente mit einem beliebigen anderen Fragment oder gar mit einem anderen DNA-Strang kombinieren. Dies geschieht über die Ligasen. Diese Enzyme wirken wie ein Klebstoff, sie können wei Nucleinsäureketten miteinander verbinden in dem sie die Reaktion zwischen Zucker- und Phospahtresten fördern. Es können aber beim schneiden der DNA durch die verschiedenartige Beschaffenheit der Restriktionsenzyme verschieden lange Enden entstehen. Diese sind aber nur komplementär zueinander, wenn beide mit dem gleichen oder mit einem Restriktionsenzym mit der gleichen Erkennungssequenz gespalten wurden. Wenn dies nicht der Fall ist, so muß mit Hilfe von 'Reperatur-Enzymen' eines der beiden Enden verlängert werden oder die ungepaarten Basen am längeren Ende mit Hilfe einer Exonuklease abgebaut werden. Sind die beiden Enden nicht komplementär obwohl sie die gleiche Länge besitzen, so werden beide Enden komplett abgebaut und es entstehen glatte Enden, gleich denen, die durch einige Restriktionsenzyme entstehen. Diese glatten Enden lassen sich aber nicht so ohne weiteres Verknüpfen. Hierzu wird die sog. Terminale Nukleotid-Transferase benötigt. Sie ergänzt mit Hilfe von Zucker, Phosphatresten und Basen einen Strang um ein Ende. Dabei baut sie gerade die Base ein, die zur Verfügung steht. Man kann diesen Vorgang nun insofern steuern, als daß man zu jedem Strang die Transferase und jeweils eine Basensorte gibt, die zu der Base mit der der andere Strang inkubiert wird komplementär ist. So entstehen z.B. reine Cytosin-Enden , die dann reinen Guanin-Enden gegenüberstehen, und sich somit verbinden können.
Mit Hilfe der Restriktionsendonucleasen ist es den Forschern also möglich DNA in Stücke von bestimmter Länge zu zerschneiden und diese dann aufzutrennen. Sie fungieren quasi wie sehr feine und spezifisch schneidende Skalpelle.
Zwischen der Struktur der DNA zwischen Pro- und Eukaryonten gibt es wesentliche Unterschiede.Während bei Prokaryonten die DNA quasi als fortlaufender Text geschrieben ist, existieren in der Eukaryontischen DNA sogenannte Nonsense-Abschnitte oder besser auch Introns genannt. Die in ihnen enthaltene Basenfolge wird im Gegensatz zu der in den Exons nicht abgelesen. Diese Introns bringt man mit der Evolutionsgeschichte in Zusammenhang und zugleich beweist diese Endeckung, das der Mensch nicht von Bakterien abstammen kann, da deren DNA keine Introns enthält.
Für die Verwendung zur gentechnischen Manipulation ist nur eine RNA zu verwenden. Eine eukaryontische RNA ist nicht für gentechnische Manipulationen zu gebrauchen. Sie muß sich erst einem Vorgang unterziehen, der RNA-Splicing genannt wird. Hierbei werden die Introns aus der RNA herausgeschnitten und man erhält eine RNA die nur noch genetischen Code enthält, der auch tatsächlich abgelesen wird. Die entstandene 'gesplicte' - DNA ist nichts anderes als die bereits bekannte mRNA.

Der Forscher besitzt nun ein spezifisches RNA-Fragment das nur aus Informationen besteht, die die Zelle auch wirklich abließt und verwendet.
Würde er eine Eukaryonten-RNA ohne vorhergegangenes Splicing in einen Prokaryonten implantieren, so würde dieser auch die Introns mit ablesen , da ein Prokaryont keine Introns kennt und somit auch den Vorgang des Splicing nicht beherrscht. Doch mit dem vorliegenden RNA- Stück sind nun Manipulationen von Bakterien und Viren möglich.

 
 




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