Die HPLC-Säulen bestehen gewöhnlich aus austenitischem Chrom-Nickel-Molybdän-Stahl mit Stahlfritten als Säulenverschluß (Austenit: Eisenmischkristall, chem. Eisencarbid). Diese Säulen sind bei dem üblichen Druck in der HPLC beständig und relativ inert gegen chemische Korrosion (wichtigste Ausnahme: Chlorid-Ionen). Für analytische Messungen verwendet man Trennsäulen mit der Länge von 250 mm und 300 mm. Der innere Säulendurchmesser ist bei den meisten Säulen 4 mm und 4,6 mm. Die Säulenfüllung besteht aus porösen Teilchen, welche eine Korngröße von 3 m, 5 m, 7 m oder 10 m besitzt. Die Korngrößenverteilung, also das Durchmesserverhältnis von kleinsten zum größten Korn, sollte möglichst eng sein und nicht größer als 2 besser 1,5 sein. Je kleiner die Teilchen sind, desto größer ist der benötigte Arbeitsdruck.
Adsorptionschromatographie:
Bei der Adsorptionschromatographie wird Silicagel oder Aluminiumoxid als stationäre Phase verwendet. Auf der Oberfläche sind bei Silicagel die Silanol-gruppen gleichmäßig verteilt. Befindet sich ein Molekül in der Nähe kann eine Art schwache "Bindung" eingegangen werden. Das "Knüpfen" dieser schwachen "Bindung" nennt man Adsorption, das Auflösen derselben Desorption. Die Stärke der Adsorption und damit der k'-Wert steigt von gesättigten Kohlenwasserstoffen zu Carbonsäuren an. Das Lösungsmittel besetzt die aktiven Stellen der stationären Phase mehr oder weniger stark. Das Probemolekül kann also nur adsorbiert werden, wenn seine Wechselwirkung mit den aktiven Stellen stärker ist als die des Lösungsmittels. Die funktionelle Gruppe des Probemoleküls ordnet sich an der Adsorbensoberfläche an, wobei der Alkylrest vom Adsorbens abgewandt ist.
Abbildung 9: Anlagerung des Probemoleküls an den Adsorbens
Da der Adsorbens die Moleküle nicht nach dem aliphatischen Rest trennen kann, ist in der Adsorptionschromatographie ein Gemisch von z.B. Butanol, Pentanol und Octanol schlecht zu trennen.
Reversed-Phase-Chromatographie:
Von der Reversed-Phase-Chromatographie (RPC) spricht man immer, wenn die stationäre Phase wenig polar ist. Am häufigsten wird chemisch gebundenes Octa-decylsilan verwendet. Es sind aber auch C8- und kürzere Alkylketten im Gebrauch. Bei der RPC wird die Probesubstanz um so stärker an der Oberfläche festgehalten, je unpolarer sie ist.
Ionenpaarchromatographie:
Ionische Proben können auch mit RPC getrennt werden, wenn die Probe nur als eine schwach Säure oder Base vorliegt. Denn diese können durch Einstellen des pH-Wertes in den undissozierten Zustand gebracht werden.
In der Ionenpaarchromatographie wird der mobilen Phase ein organischer ionischer Stoff zugegeben, der die entgegengesetzte Ladung zur Probe-komponente aufweist. Es wird also ein Ionenpaar gebildet, was eigentlich ein Salz ist, aber in seinem chromatographischen Verhalten ein nicht ionisches, organisches Molekül ist.
Affinitätschromatographie:
Die Affinitätschromatographie (Affinität: Neigung von Substanzen miteinander zu reagieren) ist eine chromatographische Methode, bei der die Wechselwirkung zwischen den Probemolekülen und der stationären Phase spezifisch ist. Es gibt zwei Komponenten, die zueinander passen. Die eine Komponente, der Ligand, ist fest an den Träger gebunden. Die andere Komponente, die Probe, wird aus der Lösung adsorbiert. Die Probekomponenten, die nicht zum Liganden passen, werden von der mobilen Phase wegtransportiert. Um die Probe vom Liganden zu desorbieren, muß eine Lösung eluiert werden, welche einen Stoff enthält, der eine größere Affinität zum Liganden besitzt. In einigen Fällen braucht man auch keinen anderen Stoff, sondern ändert nur den pH-Wert.
Gelchromatographie:
Die Gelchromatographie unterscheidet sich grundsätzlich von allen anderen Methoden der Chromatographie. Die Trennung wird nicht durch Wechsel-wirkungen ausgeführt, sondern durch eine einfache Einteilung nach Molekülgröße. Probemoleküle, die zu groß für die Poren in der stationären Phase sind, werden von der mobilen Phase sehr schnell durch die Säule transportiert. Die kleineren Probemoleküle, die in die Poren gelangen, werden verzögert auf dem Detektor erscheinen. Das Lösungsmittel selbst tritt nicht in Wechselwirkungen mit der stationären Phase.
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