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Die religiösen Spannungen im Reich hatten sich unter der Herrschaft Kaiser Rudolfs II. (1576-1612) und dessen Rekatholisierungsmaßnahmen bedeutend verschärft. In vielen Teilen Deutschlands wurden protestantische Kirchen zerstört, das Recht der Protestanten auf freie Religionsausübung wurde beschnitten, und die kaiserliche Seite nahm den Augsburger Religionsfrieden als Grundlage für die Gegenreformation. Mit der Bildung der Union, einem Defensivbündnis protestantischer Fürsten und Städte im Reich, und der Liga, einem vergleichbaren Zusammenschluss der Katholisch-Kaiserlichen, wurde der politische und konfessionelle Gegensatz zwischen den beiden Parteien verfestigt; eine friedliche Lösung des Konflikts schien kaum mehr möglich.
Der Konflikt eskalierte in Böhmen. Rudolf II. hatte den böhmischen Protestanten, um sie zu beruhigen, 1609 im so genannten Majestätsbrief Religionsfreiheit garantiert. Ferdinand II., seit 1617 König von Böhmen, leitete in Böhmen jedoch wieder gegenreformatorische Maßnahmen ein und verletzte damit den Majestätsbrief. Die entsprechenden Beschwerden eines protestantischen Landtags wies der König zurück und untersagte alle weiteren Zusammenkünfte der protestantischen Stände. Daraufhin kam es zum Prager Fenstersturz bei dem Protestanten zwei königliche Beamten aus dem Fenster warfen (1618). Dies war der Beginn des Böhmischen Aufstandes, der Auseinandersetzung zwischen böhmischen Ständen und dem Haus Habsburg, die dann in den reichs- und schließlich europaweiten Konflikt mündete.
Unter der Führung des Grafen Heinrich Matthias von Thurn erzielten die protestantischen Truppen zahlreiche Anfangserfolge, und der Aufstand griff rasch auch auf andere Teile der habsburgischen Lande über. Truppen der protestantischen Union bedrohten sogar Wien, die habsburgische Hauptstadt. Die Böhmen setzten König Ferdinand ab und wählten den Kurfürsten Friedrich V. von der Pfalz, den Führer der protestantischen Union, zu ihrem König ("Winterkönig"). Ferdinand ging in die Offensive und konnte sich auf ein großes, von Maximilian von Bayern zur Verfügung gestelltes Heer der Liga stützen. Das kaiserliche Heer schlug unter dem Feldherrn Tilly die Protestanten und Friedrich floh in die Niederlanden. Nach ihrer Niederlage hatten die böhmischen Protestanten blutige Vergeltungsmaßnahmen zu erleiden:
Die Anführer des Aufstandes wurden hingerichtet, das Land zum Teil mit Gewalt rekatholisiert und etwa die Hälfte des adligen Grundbesitzes enteignet; etwa 150 000 Protestanten mussten das Land verlassen, und 1627 wurde Böhmen mit der "Verneuerten Landesordnung" fest in die habsburgischen Erblande integriert. Friedrich setzte seinen Kampf fort, doch Tilly schlug sein Heer erneut. Damit war der Sieg des Kaisers über die Protestanten vorerst gefestigt. Die Union löste sich weitgehend auf, und die pfälzische Kurwürde fiel an Herzog Maximilian I. von Bayern.
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