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Zu der Zeit als Vincenzo Galilei erkannte, dass starre Theorien in der Musik neue Formen unterdrücken, kam auch Galileo Galilei zu dieser Einsicht. Seine Erkenntnis war, dass die aristotelische physikalische Theorie neue wissenschaftliche Untersuchungen behindere. In Vallombroso wurde Galileo zunächst von Mönchen unterrichtet und 1581 schrieb er sich in der Universität von Pisa ein um Medizin zu studieren. Wenig später wendete er sich der Mathematik und Philosophie zu und lehrte 1589 an der Universität von Pisa. Er widerlegte anschaulich die irrtümliche aristotelische Lehrmeinung - nach der die Fallgeschwindigkeit dem Gewicht eines Körpers proportional sei - indem er gleichzeitig zwei unterschiedlich schwere Gegenstände vom schiefen Turm von Pisa fallen ließ. Sein Vertrag mit der Universität von Pisa wurde 1592 nicht verlängert, vermutlich weil er im Widerspruch zu den Gelehrten stand, die die aristotelische Lehrmeinung vertraten. Im gleichen Jahr wurde ihm der Lehrstuhl für Mathematik an der Universität Padua übertragen und er lehrte dort bis 1610.
In Padua erfand Galilei den Proportionalzirkel zur praktischen Lösung mathematischer Probleme. Er wandte sich immer mehr der spekulativen Physik ab und forschte auf dem Gebiet der Mechanik. Zunächst zeigte Galilei kaum Interesse für Astronomie, obwohl er 1595 der kopernikanischen Theorie (Die Erde dreht sich um die Sonne) gegenüber dem ptolemäischen Weltbild den Vorrang gab. 1609 baute Galilei ein Fernrohr nach, das ein Jahr zuvor in den Niederlanden erfunden worden war. Dadurch dass er es dem Dogen von Venedig vorführte (es brachte großen Nutzen für die Marine und Seefahrt) wurde sein Gehalt verdoppelt und eine lebenslange Anstellung als Professor zugesichert.
Ende 1609 baute Galilei ein Teleskop mit zwanzigfacher Vergrößerung, mit dem er den Mond erforschen konnte. Unteranderem erkannte er, dass die Milchstraße aus Sternen besteht und entdeckte die vier größten Jupitermonde. Diese Erkenntnisse wurden im März 1610 in Siderus Nuncius veröffentlicht. Durch den Ruhm wurde Galilei Hofmathematiker in Florenz und von seinen Lehrpflichten befreit und konnte sich somit ganz dem Forschen und Schreiben widmen. Galilei hatte im Dezember 1610 die Venus mit ihren Phasen beobachtet und sein kopernikanisches System bestätigt. Seine Entdeckungen standen im Widerspruch mit der aristotelischen Auffassung, wonach im All nur kugelförmige Körper vorkommen. Auf eine basierende Auseinandersetzung mit den Professor von Florenz in Pisa über die Hydrostatik, veröffentlichte Galilei 1612 ein Buch über schwimmende Körper. Dennoch wurden Galileis Auffassungen verworfen. Galilei veröffentlichte 1613 eine Arbeit über Sonnenflecken und sagte den Sieg der kopernikanischen Theorie voraus. In Galileis Abwesenheit wurde den Medici von einen Professor aus Pisa mitgeteilt, dass der Glaube an eine sich bewegende Erde ketzerisch sei.
Anfang 1616 wies Robert Bellarmine Galilei an, dass er die Auffassung einer sich bewegenden Erde nicht mehr behaupten oder verteidigen dürfe. Unteranderem nahm er seine Studien wieder auf und verfasste sein Denken über Kometen in einem Buch.
Ab 1624 arbeitete Galilei an ein Buch über ptolemäische und die kopernikanischen Hypothesen in Bezug auf die Physik der Gezeiten. 1630 ließen die katholischen Zensoren in Rom das Buch zum Drucken zu, nur der Titel musste geändert werde. Schließlich wurde das Buch 1632 in Florenz veröffentlicht. Trotz behördlicher Genehmigungen wurde Galilei der Ketzerei beschuldigt und musste 1633 abschwören und wurde zu lebenslanger Haft verurteilt.
In seinem letzte Buch (Unterredungen und mathematische Demonstrationen über zwei neue Wissenszweige, die Mechanik und die Fallgesetze betreffend), das 1638 in Leiden erschien, überprüfte und verbesserte er seine früheren Bewegstudien oder die Prinzipien der Mechanik. Das Buch eröffnete einen Weg, der zu Newton führte - zum universellen Gravitationsgesetz, das die Koper´schen Planetengesetze mit Galileis mathematischer Physik verband. Vor der Veröffentlichung des Buches erblindete Galilei und starb am 8. Januar 1642 in Arcetri bei Florenz.
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