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Kolumbus traf sofort Vorbereitungen für eine zweite Expedition, die im September 1493 mit 17 Schiffen und etwa 1 500 Mann Besatzung Spanien verließ. Sie landeten auf den karibischen Inseln Dominica, Guadeloupe und Antigua. Am 27. November ankerten die Schiffe vor La Navidad in Española, und die Spanier stellten fest, dass das Fort zerstört und die Männer getötet worden waren. Kolumbus überließ die Ruinen sich selbst. Nahe dem heutigen Kap Isabella (Dominikanische Republik) gründete er die Kolonie Isabella, die erste Niederlassung von Europäern in der Neuen Welt. Im Frühjahr 1494 verließ er die Kolonie, um die Küste von Kuba zu erkunden, das Kolumbus zum asiatischen Festland rechnete. Weitere Erkundungsfahrten betrafen Jamaika und Puerto Rico.
Bei seiner Rückkehr nach Isabella am 29. September hatte sich ein tiefer Streit unter den Kolonisten und der Mannschaft entfacht. Dieser war auf die Haltung der Indianer zurückzuführen, die Kolumbus und seine Begleiter zunächst sehr freundlich empfangen hatten, ihnen aufgrund der schlechten Behandlung durch die Siedler nun jedoch feindlich gegenüberstanden. Kolumbus besiegte die Indianer auf einem Feldzug im März 1495 und verschiffte eine große Zahl von ihnen nach Spanien, um sie dort als Sklaven zu verkaufen. Königin Isabella lehnte dies jedoch ab, und die Überlebenden wurden zurückgesandt. Im Oktober 1495 kam eine königliche Untersuchungs- und Aufsichtskommission in Isabella an. Da diese seiner Politik kritisch gegenüberstand, gründete Kolumbus eine neue Hauptstadt mit Namen Santo Domingo, überließ seinem Bruder Bartholomäus das Kommando und brach nach Spanien auf. Er erstattete Ferdinand und Isabella persönlich Bericht, die daraufhin die Kommission entließen. Sie versprachen außerdem, eine neue Flotte zu unterstützen. Da das ganze Unternehmen bisher jedoch nicht den erhofften raschen Gewinn erzielte, dauerte es annähernd zwei Jahre, bis acht Schiffe erneut in See stechen konnten.
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