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Restriktionsenzyme/Klebrige Enden (sticky ends)/Plasmide
Im Jahre 1970 wurde zufällig ein Bakterium-Enzym entdeckt, das in der Lage war, Fremd-DNA an bestimmten Stellen in Bruchstücke zu zerlegen. Heute sind über 100 dieser Restriktionsenzyme im Handel. Sie erkennen ihre Schnittstelle auf dem DNA-Doppelstrang an einer Sequenz von 4 bis 6 Basenpaaren. Manche Restriktionsenzyme trennen ihre Schnittstelle versetzt, so daß an den DNA-Fragmenten kurze einsträngige Enden überstehen. Diese einsträngigen Enden neigen dazu, sich mit komplementären Einzelstrangabschnitten zusammenzulagern. Sie werden deshalb klebrige Enden (sticky ends) genannt.
Restriktionsenzyme sind die Werkzeuge der Gentechniker. Man mischt isolierte DNA unterschiedlicher Herkunft und behandelt sie mit Restriktionsenzymen, wodurch DNA-Stücke mit klebrigen Enden entstehen. Im Gemisch kommt es zur zufälligen Zusammenlagerung unterschiedlicher DNA-Fragmente. Durch Zugabe des Enzyms DNA-Ligase werden die neukombinierten DNA-Fragmente fest verknüpft.
Um ein isoliertes Gen in ein Bakterium einzuschleusen, benutzt man bakterielle Plasmide (das sind kleine DNA-Ringe, die nur wenige Gene tragen und die Zellmembran passieren können). Die Plasmide werden isoliert und mit einem Restriktionsenzym an einer Stelle geöffnet. Dazu gibt man das isolierte Gen mit dem entsprechenden klebrigen Ende und fügt die verknüpfende DNA-Ligase hinzu. Es entstehen rekombinierte Plasmide, die mit einer Wirtszelle durch Weitergabe an die Tochterzellen vermehrt werden. Um die transgenen Bakterien zu bestimmen, nimmt man als Ausgangsplasmid einen DNA-Ring, der als Marker ein Gen für eine spezifische Antibiotikaresistenz trägt. Am Ende des Versuchs gibt man das betreffende Antibiotikum zur Bakteriumkultur. Es überleben dann nur die Bakterien, bei denen ein Einschleusen des Plasmids erfolgte. Diese werden vermehrt, und man prüft, ob sie das gewünschte Produkt herstellen.
Sense-Orientierung
In der Grundform besteht ein Gen aus zwei wesentlichen Einheiten, dem Promotor und der eigentlichen Informationseinheit, der codierten Region. Der Promotor bestimmt, zu welchem Zeitpunkt und an welchem Ort das Gen aktiviert wird, während die codierte Region das Produkt, das gebildet wird, bestimmt. Bei der Sense-Orientierung (vorwärts) von Promoter und codierter Region wird sie ordnungsgemäß abgelesen. Man kann nun den Promotor und die codierte Region verkehrt herum fusionieren (Antisense). Die Folge ist, daß das normalerweise von diesem Gen codierte Protein nicht mehr gebildet wird. Auf diese Weise können Stoffwechselprozesse an ausgewählten Stellen blockiert werden.
Bei der "Antimatsch-Tomate" zum Beispiel wurde die Produktion eines Enzyms reduziert, das normalerweise zum Erweichen der Zellwand während der Fruchtreifung beiträgt.
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