3.1 Definition Gentechnik
Die Gentechnik ist das Verfahren zur gezielten Veränderung genetischer Eigenschaften eines Organismus durch Eingriff in dessen Erbmaterial. Außerdem umfasst das Gebiet alle experimentellen Methoden mit denen DNA-Abschnitte neukombiniert werden können. Dies ermöglicht eine besonders leichte Gewinnung bestimmter Nukleinsäuresequenzen oder Proteine in Bakterien oder Hefezellen.
3.2 Restriktionsenzyme und DNA-Ligasen
Alle Methoden der Gentechnik liegen der Anwendung der Restriktionsenzyme zugrunde, welche eine der wichtigsten \"Handwerkszeuge\" der Gentechniker sind.
Erst durch die Restriktionsenzyme ist es möglich geworden eine bekannte DNA-Sequenz aus einem DNA-Strang herauszulösen. Sie erkennen Sequenzen aus vier hintereinanderliegenden Basen in der DNA. Dann lagert sich das Enzym an den DNA-Strang an und schneidet an der Erkennungssequenz den Basenstrang durch. Bis heute sind über 150 Restriktionsenzyme bekannt, welche alle verschiedene Basensequenzen erkennen. Zuerst wurden diese Enzyme in Bakterien entdeckt und können nun auch selber chemisch hergestellt werden. Die Enzyme spalten den
Strang, so dass die Enden nicht genau gegenüberstehen, sondern das ein Einzel-
strang über den anderen hinausgeht. Die abgetrennten Enden werden auch \"klebrige Enden\" genannt, weil sie dazu neigen, sich wieder aneinander zu heften.
Ein anderes wichtiges Werkzeug für die Gentechniker sind die DNA-Ligasen. Diese Enzyme binden DNA-Abschnitte dauerhaft fest in die DNA ein. Wenn man DNA-Stücke in eine Bakterienzelle einbringt setzen sich diese in die freien Lücken in der DNA. Erst nach dem wirken der DNA-Ligasen sind diese Abschnitte fest in das Erbgut integriert.
3.3 Methoden der Gentechnik
3.3.1 Gewinnung einer DNA-Sequenz
Zuerst muss bekannt sein, welchen Genabschnitt mit welcher Basensequenz aus welchem Genom man benötigt. Das bestimmte Gen kann sich in der DNA eines beliebigen Organismus befinden, weil die DNA in jedem Lebewesen gleich aufgebaut ist. Zu Beginn legt man eine Zellkultur aus einer Gewebeprobe des betreffenden Organismus an. Aus den so entstandenen Zellen kann man nun das Erbgut herauslösen und reinigen. Je nach gewünschter Basensequenz wird nun das spezifische Restriktionsenzym zur gewonnenen DNA hinzugegeben. Alle entstandenen Spaltprodukte werden nun in Plasmide eingebaut und dann in Bakterien vermehrt.
Durch die Anwendung der Restriktionsenzyme kann man jedoch nicht nur die gewünschten DNA-Abschnitte aus der DNA herauslösen. Da die Basenfolge von vier Basenpaaren sich sehr oft auf dem Nukleinsäurestrang wiederholt, erhält man viele verschiedene Sequenzen aus der Gewebekultur. Die Bakterien vermehrt man nun in einem bestimmten Nährmedium. Die Gesamtheit aller vorhandenen Bakterien mit den unterschiedlichen Erbgut, das in sie eingebaut wurde, nennt man eine Genbank oder auch Genbibliothek.
Es ist nun sehr aufwendig in einer Genbank, das gewünschte Gen zu finden. Dieser Vorgang wird auch Klonselektion genannt. Zuerst werden alle Bakterien aussortiert, welche keine Plasmide aufgenommen haben. Es gibt dafür den sogenannten Blautest. In das Erbgut des Bakteriums wird vor dem Einführen der Fremd-DNA ein Gen eingebracht, welches die Information für einen blauen Farbstoff enthält. Baut sich nun ein Plasmid in das Bakterium ein, durchbricht es die Information für den Farbstoff. Somit kann man alle Zellkolonien unberücksichtigt lassen, welche eine bläuliche Färbung besitzen. Um jetzt wirklich die Bakterien zu erhalten, welche die gesuchte DNA-Sequenz enthalten, benutzt man sogenannte Gensonden. Dies ist ein kurzer DNA-Strang ( ca. zwanzig Nukleotide ) der dieselbe Basenabfolge besitzt, wie das gesuchte Gen. Er muss zuvor synthetisiert werden. Am Ende dieses Stranges wird ein radioaktiver Baustein angehängt. Gibt man diese Gensonden nun auf die Bakterienkulturen, so werden sie sich immer genau an die gewünschten DNA-Stücke anlagern. Haben sie sich an das Gen angekoppelt, so zeigt darrübergelegtes Fotopapier an, in welchen Bakterienkolonien die DNA enthalten ist. Das Fotopapier färbt sich durch den radioaktiven Marker schwarz. Diese Bakterien lässt man jetzt weiterwachsen, und damit vermehren sich auch nur diese bestimmten Gene weiter.
Diesen Prozess nennt man auch das Klonieren von DNA. Haben sich nun die entsprechenden Bakterien zahlreich vermehrt, so kann man mit dem schon einmal angewendetem Restriktionsenzym die DNA-Abschnitte herauslösen und weiterverwenden. Wird nur das Protein gebraucht, so wird das Gen im Bakterium gelassen und das gewünschte Protein kann so zahlreich gewonnen werden. Es gibt auch noch anderen Weg um die gewünschte DNA in ausreichender Menge zu erhalten. Für diesen wird jedoch die genaue Basenabfolge des Gens benötigt. In einem Synthetisierapparat kann folglich die DNA hergestellt werden, die benötigt wird.
Einerseits ist dies bei weitem einfacher als die Klonierung der DNA in Bakterien,
andererseits ist dieses Verfahren etwas teurer und die Länge des DNA-Stranges kann allerhöchstens 200 Nukleotide umfassen. Der Rest der Bakterien wird als Genbank aufgehoben für eventuelle weitere Versuche.
3.3.2 Genfähren
Die DNA-Abschnitte werden umgehend in Zellen eingebracht, welche die Information somit erhalten für neue Proteine. Genfähren sind die gebräuchlichste Art diese Gene in Zellen einzubringen. Sie sind sozusagen Behältnisse für die Gene. Sie werden unterteilt in virale und nichtvirale Genfähren.
3.3.2.1 Virale Genfähren
Virale Genfähren sind wie schon gesagt Viren, welche zum Gentransport eingesetzt werden. Sie sind nicht mit einem Lichtmikroskop sichtbar und bestehen aus einer Kapsel unterschiedlicher Form aus Eiweißen in der sich ein DNA-Strang befindet mit der genetischen Information des Virus. Um Sie zu Genfähren umzubauen wird die virale DNA oder auch RNA entfernt um das neue Erbgut einzubauen. Viren besitzen allgemein die Eigenschaft ihr Erbgut in die Zelle einzubringen, und sie dann dazu zu bringen die gewünschten Gene zu synthetisieren. Man unterscheidet bei der Anwendung für die Gentherapie die Adeno- und die Retroviren. Die Adenoviren bringen ihre Gene in den Zellkern ein, die Gene integrieren sich jedoch nicht in das Erbgut der Zelle. Dennoch werden die DNA-Stränge abgelesen und die Proteine synthetisiert und können ihre Wirksamkeit entfalten. Jedoch geht die Information für die bestimmten Proteine bei der Zellteilung verloren, weil nur die Chromosomen repliziert werden. Dadurch geht die eingeschleuste Nachricht verloren und die Therapie besitzt nur einen zeitlich begrenzten Erfolg. Dieser Nachteil ergibt sich jedoch nicht bei dem Einsatz von Retroviren als Genfähren. Diese Retroviren erstellen
von ihrem Genom eine DNA-Kopie und veranlassen sie dazu sich in das Erbgut der Zelle zu integrieren. Fraglich ist jedoch, wo sich das therapeutische Gen in das Erbgut einbaut. Dennoch bleibt das therapeutische Gen trotz der Zellteilung erhalten und kann die gewünschten Proteine weiter synthetisieren. Ein Nachteil von Retroviren ist jedoch ihre starke Tendenz zum Umbau oder Verlust ihrer eigenen Basensequenzen. Somit kann sich ihr Erbgut beliebig umbauen und sie könnten auch neuen Krebs auslösen. Dennoch besitzt der Einsatz viraler Genfähren die wahrscheinlichst größten Chancen für die Zukunft.
3.3.2.2 Nichtvirale Genfähren
Die anderen Methoden des Gentransfers beinhalten Liposomen, Mikroinjektion, UV-Laser, Elektroporation und die Partikelpistole.
In die Liposomen wird die DNA eingeschleust. Der Vorteil an Liposomen ist das sie mit der Membran verschmelzen können und ihr Erbgut in das Zellinnere abgeben. Jedoch besteht, wie bei den meisten Methoden, wie auch bei den Liposomen darum das Problem das kein Einbau der DNA in das Erbgut gewährleistet ist. Die entsprechenden Gene könnten auch mit einer extrem feinen Kanüle in den Zellkern injiziert werden und dort ihre Wirkung entfalten. Auch mit einem speziellen UV-Laser könnten Erfolge erreicht werden. Der Laser könnte kleine Löcher in die Zellmembran schießen und die DNA könnte durch diese in die Zellen eingeführt werden. Der gleiche Effekt wird durch Elektroporation hervorgerufen und die DNA könnte auch durch diesen Weg in das Zellinnnere gelangen. Der Reizstrom bildet kurzzeitig kleine Löcher in der Membran. Eine ganz andere Methode wäre der Beschuss der Zelle mit Goldpartikel welche mit Fremd-DNA beschichtet sind. Diese Partikel würden unter anderem auch in den Zellkern gelangen und dort in der Lage sein neue Proteine zu codieren.
Jedoch sind alle Methoden des Gentransfers noch immer nicht voll ausgereift und bieten auch noch nicht die Sicherheit einer routinierten Anwendung.
3.4 Gentechnisch hergestellte Medikamente - Interferon
Interferone sind körpereigene Substanzen, die Aktivität praktisch aller Komponenten des Immunsystems beeinflussen. Dadurch steigt die Abwehrkraft des Körpers gegen die meisten Krankheitserreger - gegen Bakterien und Parasiten genauso wie gegen Viren. Zudem hemmen sie die Teilung von Zellen, was erklärt, warum sie auch die Vermehrung von Krebszellen behindern.
Sie werden im Körper nur in sehr geringen Mengen produziert, so dass ihre Reinigung aus Spenderblut praktisch unmöglich ist. ( Aus 50\'000 Liter menschlichem Blut kann man nur ca. 400 tausendstel Gramm Interferon isolieren. Die Kosten hierfür wären nicht zu tragen. Die Gentechnik ermöglicht es heute, Interferone in beliebigen Mengen in Bakterien herzustellen. Das betreffende Gen für das körpereigene Interferon wird aus einer angelegten Zellkultur gewonnen durch Restriktionsenzyme. Wie schon beschrieben, wird das Gen in Bakterien eingebaut. Diese Bakterien kann man jetzt ohne riesigen Geld- und Zeitaufwand wachsen lassen. Die gewonnene Lösung kann gereinigt werden und das Interferon müsste in relativ gereinigter Form vorliegen. Bei einigen Formen von Krebs haben sie bemerkenswerte Erfolge ergeben, jedoch sprangen manche Tumore überhaupt nicht auf die Behandlung an.
Besteht ein gewünschtes Medikament aus einer bekannten Aminosäurenreihenfolge, so ist es sogar möglich DNA so zu synthetisieren, dass dann in Bakterien eingebaut werden kann, die das Medikament in beliebiger Menge herstellen können.
3.5 Anwendung monoklonaler Antikörper in der Tumordiagnostik
Antikörper sind Eiweißmoleküle, die körperfremde Strukturen, beispielsweise auf der Oberfläche von Krebszellen, erkennen und sich an ihnen festheften. Sie haben eine wichtige Funktion bei der menschlichen Immunabwehr gegen Krankheitserreger.
Treten sie mit einem körperfremden Merkmal (Antigen) in Kontakt, so setzen sie damit ein Signal für körpereigene Zellen und Mechanismen, die unerwünschten \"Eindringlinge\" durch Abwehrreaktionen unschädlich zu machen. Gebildet werden die Antikörper von einem bestimmten Typ weißer Blutkörperchen, den sogenannten Plasmazellen. Es zirkuliert ständig eine Mischung unzähliger verschiedener Plasmazellen, von denen jede ihren eigenen Antikörper herstellt. Jeder dieser hergestellten Antikörper ist ausschließlich auf die Erkennung eines bestimmten Merkmals spezialisiert. Monoklonal bedeutet Zugehörigkeit zu einer Zellfamilie (Klon) mit identischem Erbgut. Alle von einem solchen Zellklon gebildeten Antikörper sind demnach baugleich und auf die Erkennung einer bestimmten Struktur oder eines bestimmten Merkmals spezialisiert. Solche Antikörper gegen ein beliebiges Merkmal können heute außerhalb des Körpers gentechnisch in großen Mengen gewonnen werden. Dies ermöglicht den Einsatz von monoklonalen Antikörpern in Forschung und Medizin. Für die Entwicklung der Methode zur Herstellung monoklonaler Antikörper wurde Georges Köhler und Csar Milstein 1984 der
Nobelpreis für Medizin verliehen. Köhler und Milstein gelang es, eine Plasmazelle, die einen gewünschten Antikörper produziert, dauerhaft vermehrungsfähig zu machen, indem sie die Plasmazelle im Reagenzglas mit einer Tumorzelle verschmolzen. Das Verschmelzungsprodukt, ein sogenanntes Hybridom, hat Eigenschaften von jedem der beiden Partner: Von der Tumorzelle die Fähigkeit zur unbegrenzten Teilung und von der Plasmazelle die Fähigkeit zur Produktion des gewünschten Antikörpers. Alle Nachfahren dieser Mischzelle haben dasselbe Erbgut, sie bilden einen Klon. Sie produzieren daher auch stets denselben, also monoklonalen Antikörper. Mit dieser Methode können im Prinzip Antikörper in beliebigen Mengen gegen jedes beliebige Merkmal hergestellt werden. Monoklonale Antikörper sind in der medizinischen Forschung und Diagnostik mittlerweile unentbehrlich. Bei der Immunszintigraphie (Szintigraphie) nutzt man monoklonale Antikörper zur Auffindung von kleinen Tumorherden im Körper. Antikörper, die gegen bestimmte Merkmale von Tumorzellen gerichtet sind, werden mit radioaktiven Substanzen bestückt und in eine Vene gespritzt. Sie verteilen sich im Körper und reichern sich in gewissem Ausmaß im Tumorgewebe an. Mit Hilfe von speziellen \"Gammakameras\" / Counter, welche die Verteilung radioaktiver Strahlungsquellen im Körper abbildet, können sie von außen sichtbar gemacht und lokalisiert werden. Wegen verschiedener methodischer Probleme, unter anderem wegen der zu geringen Anreicherung der Antikörper im Tumorgewebe, sind die Ergebnisse der Immunszintigraphie allerdings nicht so gut, wie man sich dies wünschen würde.
Das Verfahren wird deshalb nicht routinemäßig angewendet, ist aber
dennoch eine sehr gute Ergänzung zu den herkömmlichen Krebsdiagnose.
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